informacje



Pokazywanie postów oznaczonych etykietą analityka. Pokaż wszystkie posty
Pokazywanie postów oznaczonych etykietą analityka. Pokaż wszystkie posty

sobota, 23 września 2017

Poison Story (9.) - Błękitny kwiat

Miał to być kolejny szczęśliwy dzień. Lakhvinder Cheema wrócił z pracy do swojego domu w Feltham, zachodniej dzielnicy Londynu i odgrzewał potrawkę z kurczaka w sosie curry, zagadując do swojej narzeczonej Gurjeet. A mieli dużo do obgadania, zaledwie za dwa tygodnie, w Walentynki, zamierzali wziąć ślub, który przy okazji zalegalizuje pobyt narzeczonej w Anglii. Znali się dopiero od kilku miesięcy, ale byli zupełnie zdecydowani aby przeżyć ze sobą następne lata.

Potrawka podlana ostrym sosem smakowała mu tak bardzo, że zjadł podwójną porcję. Jednak gdy już kończył w znajome pieczenie w ustach wkradło się nietypowe wrażenie drętwienia i mrowienia. Zdziwiony dotknął palcem języka i ust stwierdzając, że zupełnie nic nie czuje.
- Źle się czuję - powiedział do narzeczonej. - To chyba coś w jedzeniu.
Próbował wstać, ale nogi się pod nim załamały. Gurjeet nie mogła mu pomóc, bo sama znalazła się w podobnym stanie. Poczuła zawroty głowy a światło w kuchni osłabło aż do zupełnych ciemności. Przezwyciężając osłabienie Cheema zadzwonił na pogotowie, dodając ostatkiem sił:
- Ktoś dodał truciznę do jedzenia. To moja była dziewczyna.
Zaledwie kilka minut później oboje byli już bezwładni a ich ciałami wstrząsały drgawki. Godzinę po przyjęciu do szpitala, Cheema zmarł, a Gurjeet musiała zostać podłączona do respiratora. Najważniejszym było teraz dociec jaka substancja wywołała tak gwałtowne skutki.
Jeszcze tego samego dnia policja zatrzymała Lakhvir Singh, byłą kochankę Cheema. Podczas przeszukania znaleziono przy niej torebeczkę z drobnym, roślinnym pyłem.
- To proszek na wysypkę - tłumaczyła. Początkowo jednak nie zbadano tego tropu. Objawy były tak gwałtowne, że sądzono, że to zatrucie cyjankiem potasu.

Singh poznała Lakhvindera dawno temu. Uwikłana w niezbyt szczęśliwe małżeństwo, możliwe że aranżowane, szybko zwróciła uwagę na młodego Sikha który zaczął wynajmować u nich pokój. Był świeżo po rozwodzie, samotny, nic więc dziwnego, że między nim a żoną najemcy zawiązała się bliższa zażyłość. Nawet gdy znalazł sobie inne mieszkanie i tak przychodziła do niego niemal codziennie, gotowała, sprzątała i sypiała z nim jak prawdziwa żona. Gdy mąż Singh zachorował na raka i musiał przejść długotrwałe leczenie, uznała to za dobrą okazję aby częściej bywać z kochankiem. W trakcie trwającego 16 lat romansu dwa razy zaszła w ciążę, którą na jego prośbę usunęła.
Ale w miarę upływu lat Cheema starał się od niej oddalić, będąc zmęczony jej zaborczym podejściem. W 2008 roku krewni zaczęli swatać go z o połowę młodszą Gurjeet Choongh, która niedawno przyjechała do Anglii. Od razu się sobie spodobali i szybko formalnie się zaręczyli. Odrzucona kochanka szalała ze złości, wysyłając mu nienawistne wiadomości. Mimo to jeszcze przez pewien czas przychodziła do jego domu, aż na początku grudnia Cheema powiedział dość.
Lakvinder Cheema i jego narzeczona Gurjeet Choongh

Zbadanie rodzaju trucizny pomimo zabezpieczenia proszku z kieszeni podejrzanej, porcji nie zjedzonego sosu curry i wymiocin ofiar, okazało się jednak dużo trudniejsze niż się to początkowo wydawało. Cyjanek szybko wykluczono. Ze względu na objawy sugerujące porażenie nerwów, brano pod uwagę neurotoksyczne pestycydy, ale mogły być to też trucizny roślinne. Trudno było choćby przybliżyć rodzaj substancji, dlatego analitycy postanowili użyć metody najbardziej ogólnej, która powinna wykrywać i zidentyfikować niemal wszystko - analizy chromatograficznej sprzężonej ze spektrometrią mas.

Chromatografia to metoda rozdziału mieszanin oparta o różne powinowactwa składników mieszaniny do adsorbentu wypełniającego długi przewód lub kolumnę. Każda substancja, której roztwór lub opary są przepuszczane przez dobrze adsorbujący, porowaty materiał, w jakimś stopniu oddziałuje z jego powierzchnią. Siła tego oddziaływania zależy w dużym stopniu od tego jaka to jest cząsteczka, a więc jakie ma grupy funkcyjne, jaki ma moment dipolowy, hydrofilowość, rozmiar cząsteczki itp. Jedne będą więc mocniej się wiązały z wypełnieniem a inne słabiej. Podczas przepuszczania porcji mieszaniny substancji przez kolumnę z odpowiednim wypełnieniem, te najsłabiej z nim oddziałujące substancje będą najefektywniej wymywane przez rozpuszczalnik, wypierane przez mocniej oddziałujące i w efekcie oddzielą się jako osobna porcja, podróżująca przez kolumnę szybciej, na przedzie.
Chromatografia wyciągu z zielonego liścia na płytce pokrytej warstwą adsorbentu. Od góry: karoten, feofityna, karotenoidy, chlorofil a i b

Sumą tych wszystkich procesów powinno być zatem pooddzielanie składników mieszaniny i możliwość zbadania czystych. Jednakowoż oddzielenie i oczyszczenie składnika mieszaniny, niczego nam o nim nie mówi, dlatego dla identyfikacji wykorzystuje się inny skutek wyżej opisanych procesów - dla danej substancji w danych warunkach czas przejścia przez kolumnę z określonym rodzajem wypełnienia jest taki sam.
Jeśli więc najpierw przepuścimy przez kolumnę mieszaninę, rejestrując detektorem pojawianie się kolejnych składników i czasy ich przebiegu, a potem, nie zmieniając warunków, małe ilości wzorców substancji których obecności się w mieszaninie spodziewamy, to stwierdzenie, że pewne składniki miały identyczny czas przebycia co dany wzorzec jest równoznaczne z potwierdzeniem, że są to te same substancje.

No dobrze. A co w przypadku gdy nie wiemy nawet jakiego użyć wzorca, bo morderczyni użyła trudno powiedzieć jakiej trucizny? Tutaj z pomocą przychodzi dołączenie do zestawu chromatograficznego detektora, który prócz wykrycia, że dotarł do niego rozdzielony składnik mieszaniny, może nam coś o nim powiedzieć - analizatora przy spektrometrii mas.

Spektrometria mas to metoda bardziej bezpośredniego badania składu substancji. Zasada działania jest generalnie bardzo prosta - jeśli zjonizujemy badaną substancję i poddamy otrzymane jony działaniu pola elektrycznego, to będą się w nim poruszać nabierając pewnego pędu. Jony o tym samym ładunku ale różnej masie w tym samym polu zyskają różny pęd. Możliwe jest zbudowanie takiego układu, w którym następować będzie odsiewanie jonów o niepasującej masie. Może to być na przykład rurka skręcająca pod ostrym kątem, w której układ magnesów tworzy kanał zaginający jony. Jony lekkie będą zbyt silnie zaginane i uderzą w ściankę, te zbyt ciężkie  nie będą się wyrabiały na zakręcie i też uderzą w ściankę. Zmieniając moc magnesów możemy zmieniać optymalny zakres mas w którym jony są w stanie przejść przez układ filtrujący. W efekcie z wiązki jonów najpierw zarejestrowane zostaną te o jednej masie a potem te o innej.
Wiedząc jak zmienialiśmy parametry układu filtrującego możemy zatem określić jaką dokładnie masę cząsteczkową musiały mieć jony które w danym momencie, po przejściu przez układ uderzyły w detektor i zostały wykryte. Szybkie przemiatanie ustawieniami analizatora po zjonizowaniu próbki da nam widmo masowe jonów powstałych z danej substancji, a to jest już w stanie powiedzieć nam coś o tym z jaką konkretnie substancją mamy do czynienia.

Zależnie od metody i siły jonizacji analizuje się bądź masy jonów pojedynczych cząsteczek, bądź masy jonów pochodnych, bowiem przy dużej energii jonizacji cząsteczka rozpada się na fragmenty. Przy dużej dokładności określenia masy możliwe jest odróżnienie różnych jonów o zdawałoby się tej samej masie molowej, w oparciu o różnice na trzecim czy czwartym miejscu po przecinku i dodatkowe sygnały od izotopów. Dla większego ułatwienia analizy oprogramowanie aparatów MS zwykle zawiera bibliotekę znanych widm masowych, z którą można porównać wyniki.

No dobra - mamy więc zestaw analityczny. Teraz tylko kwestia dobrania warunków i sprawdzenia czy wyniki zgadzają się z czymś nam znanym. Początkowo użyto techniki chromatografii gazowej, w której rozdział następuje w długiej kolumnie przez którą przepuszcza się gaz obojętny, a próbka jest odparowywana na małej grzałce, jednak ten sposób nie dał żadnych ciekawych wyników. Najprawdopodobniej użyta toksyna była mało lotna lub rozkładała się przy odparowaniu próbki.
Musiano więc przestawić się na technikę chromatografii cieczowej, z próbką rozpuszczaną w odpowiednim rozpuszczalniku. Jest to metoda o tyle gorsza, że do roztworu przechodzi dużo przeszkadzających substancji.

Dopiero teraz dało się wyłapać charakterystyczny sygnał, który pojawiał się we wszystkich trzech próbkach - roślinnym proszku, sosie curry i próbkach pobranych od otrutych. Widmo masowe pokazało stosunkowo dużą masę cząsteczkową, leżącą w zakresie w którym pojawia się wiele alkaloidów roślinnych. Po porównaniu masy głównego jonu i fragmentów cząsteczki z biblioteką zarejestrowanych widm nie otrzymano konkretnego wyniku - widocznie było to trucizna na tyle rzadko spotykana, że nie zapisano jej analiz. Jednak analiza zarejestrowanych fragmentów i wiedza na temat tego w jaki sposób przejonizowane cząsteczki rozpadają się w spektrometrze, pozwoliła dojść analitykom do wniosku, że musi być to któraś z toksyn z grupy akonityn.
Skrupulatne przejrzenie literatury doprowadziło badaczy do najbardziej prawdopodobnego wyniku - pseudoakonityny, toksyny z rosnącej w Indiach rośliny z rodzaju tojad, której europejski odpowiednik jest też znany jako ogrodowa roślina ozdobna. Aby potwierdzić przypuszczenia, laboratorium poprosiło ogród Kew Gardens o próbki roślin.


Tojad mocny, nazywany też mordownikiem, jak to wprost nazwa sama wskazuje jest rośliną silnie trującą. Należy do rodziny jaskrowatych, konkretnie plemienia Delphinieae, wraz z ostróżką i ostróżeczką. Jest byliną o charakterystycznych, głęboko podzielonych liściach i ukwieconym pędzie dorastającym do półtora metra wysokości. Kwiaty duże, intensywnie granatowe z charakterystycznym "hełmem" z przerośniętego piątego płatka. Z tego też powodu nazywany był także błękitnym lub mnisim kapturem. Występuje w Europie głownie na terenach górskich i pogórzu, kilka stanowisk znanych jest z polskich Karpat. Bardziej rozpowszechniony jest tojad mołdawski, rosnący też na wyżynach i w dolinie Wisły. Pojedyncze stanowiska na nizinach to głównie wynik ucieczki z ogrodów.
Ze względu na bardzo efektowny wygląd i intensywną barwę, tojad jest uprawiany jako roślina ozdobna. Wiele osób może go mieć u siebie nie wiedząc z jak niebezpieczną rośliną mają do czynienia, wyhodowano liczne odmiany o kolorach białym czy różowym, z plamkami czy jasnym obrzeżeniem. Jest uważana za jeden z klasycznych kwiatów tradycyjnego angielskiego ogrodu.

Właściwości tojadu poznano już bardzo dawno. Wedle mitologii greckiej miał powstać w miejscu, gdzie na ziemię spadła ślina Cerbera, demonicznego psa pilnującego wejścia do Hadesu. Czarodziejka Medea miała zatruć tojadem wino przeznaczone dla Tezeusza, gdy ten zażądał należnego mu tronu. Atena użyła tej rośliby aby zamienić dumną Arachne w pająka. Przypuszcza się, że posłużyła do otrucia cesarza Klaudiusza, któremu podano zatrutą potrawę z grzybów, przy czym szybkie pojawienie się objawów i drętwienie języka nie bardzo pasowały do trujących grzybów; podobne podejrzenia dotyczą śmierci jego syna Brytanika. W późniejszych wiekach zyskała sławę "roślinnego arszeniku".
Ludy zamieszkujące Syberię, Kazachstan i Kamczatkę, oraz Ajnowie będący pierwotnymi mieszkańcami północnych wysp archipelagu japońskiego, używały soku z tojadu do zatruwania strzał i wnyków podczas polowania na niedźwiedzie czy łosie.

Podobnie jak inne silnie trujące rośliny, tojad był dawniej używany w medycynie. Skoro bowiem toksyna działa na organizm tak silnie, to w odpowiednio dobranej dozie powinna być silnie lecznicza. Medycyna europejska stosowała tojad i preparaty pochodne jako środek pobudzający czynności organów. W bardzo małych dawkach wskutek podrażnienia zakończeń nerwowych poprawiała pracę układu pokarmowego i krążenie, równocześnie uspokajając pracę serca. Wyciągi użyte zewnętrznie powodowały porażenie nerwów czuciowych a co za tym idzie lokalne znieczulenie. Używano go jednak ostrożnie, bowiem naturalny surowiec posiadał mocno zmienną zawartość toksyny i trudno było precyzyjnie dobrać dawkę.[1]
W medycynie chińskiej i ayurwedyjskiej lokalne gatunki tojadu są środkiem rozgrzewającym i zwiększającym poziom energii w nerkach, stąd też chętnie używany w przewlekłych chorobach związanych ze starością, których przyczyną miało być "wychłodzenie" i gromadzenie się "wilgoci". Roślina musiała być w tym celu odpowiednio przygotowana aby obniżyć jej toksyczność. Najczęściej brano pojawiające się jesienią bulwki korzeniowe i bardzo długo gotowano, przez co toksyna bądź częściowo rozkładała się, bądź była wymywana. Gorzkie w smaku bulwki zawierają skrobię, dlatego lokalnie są spożywane po prostu jako warzywo. Łukasz Łuczaj miał okazję spróbować takiego właściwie przyrządzonego dania.[2]

Główną toksyną europejskiego tojadu jest akonityna, alkaloid o dość skomplikowanej, przestrzennej budowie:
Należy do najsilniejszych toksyn roślinnych, dawka śmiertelna czystej substancji to zaledwie 1 mg/kg m.c. ustnie dla myszy, dla człowieka szacowane LD 50 to 3-4 mg/kg. Dawka toksyczna przy podaniu dożylnym lub przezskórnym jest jeszcze niższa. Odpowiada to spożyciu około 2 gramów rośliny lub 20-30 ml nalewki. Najbardziej toksyczna jest jesienna bulwa korzeniowa oraz nasiona. Nie znalazłem informacji czy toksyna występuje też w płatkach kwiatów.
Jest stosunkowo dobrze wchłaniana przez skórę. Podczas prac ogrodowych trzeba pamiętać aby nie pobrudzić skóry sokiem z łodyg, powoduje bowiem pieczenie a potem znieczulenie, może nawet miejscowe zdrętwienie.  W 2014 roku ogrodnik pracujący w rezydencji milionera Christophera O. Thompsona stracił przytomność. Po przewiezieniu do szpitala zmarł z powodu ustania czynności narządów. Po kilku tygodniach pojawiło się podejrzenie, że mógł zatruć się tojadem, który w tym czasie kwitł. Prawdopodobnie ścinając rośliny z rabaty, pobrudził ręce dużą ilością soku, dalej toksyna bądź wchłonęła się przez skórę bądź została połknięta z jakąś kanapką. Ostatecznie nie udało się tej wersji potwierdzić, bo możliwość taką zgłoszono już po pogrzebie, gdy próbki krwi były już zutylizowane. [3]

Działanie toksyczne akonityny wynika z zaburzenia działania komórek nerwowych. Przeciętna komórka nerwowa utrzymuje we wnętrzu  nierównowagę ilości jonów, wyrzucając je za pomocą kanału jonowego tzw. pompy sodowo-potasowej. Jest to baryłkowaty twór ze splecionych łańcuchów białkowych, który przechodzi na wylot przez błonę komórkową. Wyrzuca on na zewnątrz dodatnio naładowane kationy sodu, przez co na błonie powstaje niewielki ładunek ujemny. Impuls nerwowy powstaje gdy kanał jonowy otworzy się, a kationy sodu napływają do komórki. Potencjał elektryczny błony najpierw staje się zerowy (depolaryzacja) a potem na krótko dodatni. Potem kanał się zamyka i w ciągu następnych kilku mikrosekund pompa wyrzuca kationy sodu na zewnątrz, przywracając pierwotny potencjał. Powstały w ten sposób impuls zmiany potencjału rozchodzi się od neuronu do neuronu, generując przepływ informacji i umożliwiając między innymi czytanie tego tekstu.

Kanały jonowe generujące impulsy mogą być otwierane dzięki czynnikom chemicznym które łączą się z odpowiednimi receptorami białkowymi mającymi połączenie z takim kanałem. Naturalne takie substancje to neuroprzekaźniki, zaś te sztuczne to najczęściej substancje pobudzające i psychoaktywne.
Akonityna po dostaniu się do organizmu przyłącza się do białkowej podjednostki alfa kanałów jonowych i powoduje, że po otwarciu takiego kanału, jego zamknięcie następuje później niż zwykle. Skutkuje to przedłużeniem fazy depolaryzacji. Jeśli wiele takich kanałów na powierzchni komórki nerwowych zostało obsadzonych przez cząsteczki akonityny, faza depolaryzacji może trwać tak długo aż neuron przestanie wysyłać i odbierać impulsy. Jeśli zaś z kolei tych niemych neuronów będzie w organizmie odpowiednio dużo, to zatrzymanie impulsów zatrzymuje pracę narządów.
Hamowanie impulsów w nerwach obwodowych skutkuje osłabieniem pracy mięśni. Dalej pojawia się porażenie mięśnia sercowego. Działanie na mózg wywołuje brak odbioru wrażeń zmysłowych. Nieskoordynowane próby odnowienia aktywności mózgowej kończą się drgawkami, zaburzeniami oddychania i krążenia. Ostatecznie śmierć następuje po ustaniu oddechu lub pracy serca, prawdopodobnie przy zachowanej świadomości.
To zdecydowanie nie jest przyjemna śmierć.

W przypadku zatrucia pokarmowego leczenie polega na zapobiegnięciu dalszego wchłaniania trucizny, poprzez płukanie żołądka i podanie węgla aktywnego.  Należy sztucznie podtrzymywać oddech a czasem też pracę serca, do czasu aż receptory nie zostaną odblokowane a toksyna usunięta. Odtrutką specyficzną jest atropina, alkaloid bielunia, która ma na komórki nerwowe działanie przeciwne.

Jak wspomniałem, tojad należy do rodziny jaskrowatych a konkretnie do "plemienia" Delphinieae. Do tej samej grupy należy inny popularny kwiat ostróżka, oraz częsty chwast polny ostróżeczka. Obie te rośliny także mogą zawierać substancje o podobnej budowie, głównie metyllykakonitynę. Toksyna ostróżki ma działanie kilkukrotnie słabsze od akonityny a ponadto występuje w dużo mniejszej ilości. Ze względu na działanie na receptory nikotynowe była testowana jako środek pomagający rzucenie palenia, ma ponadto działanie przeciwstawne do cannabioidów. Wyciągi z ostróżki są czasem stosowane w "ekologicznych" opryskach przeciwko bielinkowi kapustnemu i innym owadom będącym szkodnikami warzyw.
Z kolei ostróżeczka polna, będąca chwastem, i uprawiana jako ozdobna ostróżeczka ogrodowa zawierają niewielką ilość alkaloidów, które od dawna są wykorzystywane w preparatach przeciwko wszom i pchłom.

Jak skończyła się sprawa o otrucie Cheema?
Gdy już dowiedziono, że użytą trucizną był tojad, pozostawało tylko udowodnić Lakhvir Singh winę. Znaleziono przy niej roślinny proszek będący sproszkowanym indyjskim gatunkiem tojadu Aconite forex, zawierającym pseudoakonitynę, a więc ten sam alkaloid który ostatecznie po długich badaniach udało się wykryć w próbkach od zatrutych. Ona sama tłumaczyła jednak, że to używane przez nią zioła i że niczego byłemu narzeczonemu nie dosypywała.
Sprawdzono skąd mogła mieć proszek - kilka tygodni wcześniej była na krótko w Indiach, tam kupienie większej ilości nie nastręczało żadnych trudności. Zeznania Gurjeet, którą ostatecznie udało się odratować, także dużo wniosły. Próby definitywnego zakończenia poprzedniego związku były dość burzliwe. Singh jeszcze wielokrotnie przychodziła do domu byłego kochanka, robiąc mu awantury i strasząc, że załatwi deportację jego narzeczonej. W międzyczasie wyszło na jaw, że Cheema oszukiwał narzeczoną, mówiąc jej że rozstał się z panią Singh trzy lata temu i teraz są tylko przyjaciółmi. Była zaskoczona gdy dowiedziała się, że jeszcze niedawno spędzała u niego wolne dni. W Boże Narodzenie 2008 narzeczeni uczestniczyli w spotkaniu towarzyskim, na którym znalazła się też Singh. Gurjeet próbowała po przyjacielsku załatwić sprawę mówiąc jej, że wie o wszystko o ich wieloletnim romansie i radziła jej, że powinna jednak mimo wszystko zająć się mężem i trójką dzieci. To jednak nie poskutkowało.
  Na początku stycznia 2009 Singh znów przyszła do domu kochanka, robiąc awanturę o to, że narzeczeni już ze sobą śpią choć nie mają ślubu. Wiedziała to bo zakradła się pod dom i podglądała ich przez okno. Dwa tygodnie później narzeczeni zatruli się sosem curry.

Kolejną zastanawiającą okolicznością było wcześniejsze zatrucie. Cheema zatruł się na początku grudnia potrawką warzywną i kilka dni spędził w szpitalu. Stało się to kilka dni po poważnej rozmowie, podczas której odtrącił Singh. Już wtedy podejrzewał, że dodała mu czegoś do jedzenia, ale zbagatelizował sprawę, bo w końcu zatrucie nie było silne.
Za dowód rozstrzygający uznano jednak zeznania dwóch lokatorów Cheemy, którzy po południu w dniu tragicznego zdarzenia, widzieli jak Singh przyszła do domu byłego kochanka, otwierając sobie własnymi kluczami. Nie bardzo się orientowali jak to między nimi ostatecznie było i jak się dogadali, a ponieważ widywali ją już wcześniej, nie widzieli niczego podejrzanego w tym, że skierowała się do kuchni i zaglądała do lodówki.

Na początku 2010 roku Lakhvir Singh została skazana na dożywocie z  możliwością przedterminowego zwolnienia dopiero za 23 lata. O tym jak wyjątkowy i rzadki jest to przypadek świadczy to, że poprzedni wyrok w sprawie o otrucie tojadem zdarzył się w Wielkiej Brytanii w roku 1892.
---------------------------------
Źródła:
[1]  http://www.independent.co.uk/news/uk/home-news/gardener-dies-after-brushing-against-deadly-wolfsbane-flower-on-millionaires-estate-9845675.html
[2]  http://rozanski.li/278/tojad-mocny-aconitum-napellus-l-ranunculaceae-jak-to-dawniej-z-nim-bylo-w-medycynie/
[3] http://lukaszluczaj.pl/tojad-lek-pozywienie-i-trucizna-w-jednym/

* https://www.chemistryworld.com/feature/its-a-bloody-business/8378.article
* http://akrokorinthos.blogspot.com/2013/11/the-poison-aconite-or-wolfsbane.html
*  https://en.wikipedia.org/wiki/Aconitine
* https://en.wikipedia.org/wiki/Methyllycaconitine
*  http://murderpedia.org/female.S/s/singh-lakhvir.htm

sobota, 3 października 2015

Kiedyś w laboratorium (47.)

Kiedyś na zajęciach z analityki robiliśmy doświadczenie z elektroforezą aminokwasów.

Aminokwasy zgodnie z nazwą są związkami, które zależnie od warunków mogą być kwasami lub zasadami - posiadają grupę karboksylową mogącą odszczepiać proton, która zwykle decyduje o właściwościach kwaśnych, oraz grupę aminową która mogłaby przyjąć proton w odpowiednio zakwaszonym środowisku. W szczególnych warunkach zjonizowane są obie grupy i punkt ten nazywany izoelektrycznym.
 Ponieważ w aminokwasach o różnej budowie stała protonowania grupy aminowej i stała deprotonacji grupy karboksylowej przybierają różne wartości, toteż w roztworach o tym samym odczynie różne aminokwasy będą przyjmowały bądź formę anionu bądź kationu. A gdy do roztworu przyłożymy napięcie elektryczne, każdy pomknie w inną stronę.

Przyciąganie jonów do elektrody o przeciwnym znaku powoduje ich migrację, której prędkość zależy od wielkości i stopnia naładowania cząsteczki. Wskutek tego możliwy staje się rozdział naładowanych cząstek w polu elektrycznym na podobnej zasadzie jak to się ma przy chromatografii. Techniki tej używa się do rozdziału białek, peptydów i fragmentów DNA na przykład podczas badań genetycznych, co kiedyś już opisywałem.

W tym przypadku jednak poprzestaliśmy na sytuacji dużo prostszej - na kilka pasków bibuły nasączonej przewodzącym buforem nałożyliśmy próbki kilku aminokwasów i przez pewien czas podłączyliśmy paski do elektrod. Te aminokwasy które w odczynie buforu były anionami pomknęły w stronę elektrody dodatniej zaś te będące kationami w stronę elektrody ujemnej. Plamy aminokwasów ujawnialiśmy ninhydryną:
Jak dogrzebię się do starego zeszytu to dopiszę jeszcze który pasek odpowiadał któremu z aminokwasów.

poniedziałek, 9 marca 2015

I grupa analityczna kationów

Podczas zajęć z chemii analitycznej starałem się robić zdjęcia każdej grupie i reakcji z każdym odczynnikiem. Różnej natury przyczyny sprawiły, że wszystkiego sfotografować się mi nie udało, ale coś tam zawsze można pokazać.

Klasyczna analiza nieorganicznych soli polega na przetestowaniu prostych reakcji dających osady o charakterystycznych właściwościach, tylko dla niektórych stosuje się dodatkowe odczynniki specyficzne. Rozpoznanie kationu opiera się na zgodności obserwowanych przemian z opisanymi w literaturze - musi powstać lub nie osad, o odpowiednim kolorze, rozpuszczający się lub nie w odpowiednim odczynniku.
 Metody te mają znaczenie przede wszystkim dydaktyczne, bo w praktyce w analizie próbek na obecność metali używa się innych metod. Wymagają ona stosunkowo dużych ilości soli (aczkolwiek dużą ilość tych reakcji można przeprowadzać na pojedynczych kroplach, dzięki czemu możliwe staje się zbadanie pojedynczych okruchów).
Zależnie od tego jak sole reagują z pewnymi podstawowymi odczynnikami, pogrupowano je i podzielono. Dziś omówię grupę I, czyli jony metali, które dają osady po dodaniu kwasu solnego.

Ag, Hg(I),Pb(II)
+ Cl-
Po dodaniu odczynnika grupowego, czyli kwasu solnego lub roztworu chlorku sodu, wszystkie kationy wytrącają się w formie białych chlorków:

Od lewej Hg22+ ,Ag+ ,Pb2+ .
Powstające chlorki srebra, ołowiu i rtęci (I) to białe, nieco kłaczkowate osady. Chlorek srebra jest światłoczuły i po pewnym czasie ciemnieje, najpierw stając się szaro-fioletowy aż w końcu czarny. Zanim to jednak nastąpi, można go odróżnić od pozostałych za sprawą ciągu reakcji - po dodaniu roztworu amoniaku rozpuszcza się, tworząc kompleks chlorku aminasrebra, po dodaniu rozcieńczonego kwasu azotowego, osad chlorku pojawia się ponownie.
Zarówno chlorek srebra jak i ołowiu mogą rozpuścić się w nadmiarze odczynnika, dlatego powinno się używać raczej rozcieńczonego. Chlorek ołowiu rozpuszcza się na gorąco, przy ochłodzeniu tworząc białe igiełkowate kryształki.
+ NH3*H2O
Po dodaniu rozcieńczonego amoniaku do roztworów, wytrącają się różne osady:
Niestety ujawnia się tu złośliwość substancji - w próbówce prawej, zawierającej sól srebra, osad powstał podczas nalewania odczynnika i po chwili się rozpuścił. Szary osad tlenku srebra jest rozpuszczalny w nadmiarze i stąd takie efekty.
W próbówce po lewej wyraźny ciemnoszary osad, o skomplikowanym składzie. W reakcji z jonami amonowymi i hydroksylowymi zamiast oczekiwanego wodorotlenku, rtęć (I) tworzy sól aminortęciową oraz rtęć metaliczną, która zabarwia osad na szaro.
+ KJ (jodek potasu)
W tym przypadku pojawiają się osady o wyraźniejszych kolorach:


Od lewej: Hg22+, Pb2+, Ag+ . Osad jodku rtęci jest zielonkawy i dosyć ciemny, zawiera prawdopodobnie domieszki metalicznej rtęci. Nadmiar odczynnika powoduje rozpuszczenie jodku rtęci (I) z równoczesną dysproporcjonacją w wyniku której do roztworu przechodzi kompleks tetrajodku rtęci (II) a wytrąca się koloid metalicznej rtęci. Taki roztwór mógłby stanowić w zasadzie odczynnik Nesslera, używany do oznaczania jonów amonowych, ale zazwyczaj otrzymuje się go inną metodą..
Jodek ołowiu jest żółty. Rozpuszcza się w wodzie na gorąco, po ochłodzeniu wykrystalizowuje w formie żółtych blaszek o połysku podobnym do płatków złota, stąd też był kiedyś używany w żółtych farbach. Rozpuszcza się też w nadmiarze odczynnika.

Jodek srebra jest lekko żółtawy, z czasem ciemnieje od światła.
+ dichromian potasu
Intensywne kolory wywołuje także reakcja z dichromianem:
Chromian srebra jest czerwonym, drobnym osadem, rozpuszczalnym w amoniaku lub rozcieńczonym kwasie azotowym. Pośrodku widzicie intensywnie żółty chromian ołowiu, dawniej używany jako pigment malarski "żółcień ołowiana" obecnie rzadko używana ze względu na toksyczność. Chromian rtęci jest ciemnobrunatny, choć podobno podczas dłuższego gotowania zmienia się w czerwony.
+AKT
AKT to często stosowana, wygodniejsza w użyciu forma siarczków. Związek organiczny, amid kwasu tiooctowego, który w środowisku kwaśny i podczas ogrzewania ulega hydrolizie z wydzieleniem siarkowodoru. Strąca siarczki z roztworów soli metali
Z badanymi solami daje odpowiednie osady:

Osad siarczku srebra jest raczej szarawy i kłaczkowaty. Z nieznanych mi przyczyn czarny siarczek ołowiu się nie wytrącił, stąd pusta próbówka. W przypadku rtęci (I) zachodzi dysproporcjonacja, strąca się osad będący mieszanką metalicznej rtęci i siarczku rtęci (II).

Oprócz wymienionych podstawowych prób, istnieją też próby charakterystyczne, na przykład reakcja soli srebra z reduktorami może spowodować powstanie lustra na ściankach próbówki. Ołów reaguje z rodizonianem potasu dając ciemnofioletowy osad. Rtęć (I) tworzy z difenylokarbazydem charakterystyczny niebiesko-fioletowy kolor; reakcja jest bardzo czuła i wykorzystuje się ją do kolorymetrycznego oznaczania śladowych ilości rtęci.

----------

wtorek, 8 kwietnia 2014

Azot Kjeldahla

Kiedyś kiedyś, w laboratorium... Na zajęciach z chemii środowiska badałem zawartość azotu w żywności metodą Kjeldahla.


Białka z jakich zbudowane są żyjące organizmy, składają się z aminokwasów, zawierających azot. Chcąc więc oznaczyć zawartość białka w pożywieniu mierzy się zazwyczaj po prostu zawartość azotu. Metodę tą wymyślił duński chemik pracujący na potrzeby browarów - zawartość białka w ziarnie przekłada się na właściwości słodu a te na jakość piwa.
Sama idea jest dosyć prosta - próbkę żywności roztwarza się w kwasie siarkowym w wysokiej temperaturze. W takich warunkach białka, skrobia i większość innych substancji ulegną zniszczeniu, zaś azot pochodzący z amin, głównie tych w białkach, ulegnie zamianie w siarczan amonu.
NR'+ H2SO4 → (NH4)2SO4 + CO2 + H2O
Po zalkalizowaniu roztworu mocną zasadą, siarczan amonu rozłoży się z wydzieleniem amoniaku:
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O + 2NH3
Amoniak jest bardzo lotny więc podczas gotowania roztworu odparuje i wraz z parą wodną będzie skraplany w chłodnicy. Rozpuszczony w wykroplinach amoniak musi być teraz schwycony w roztworze. W tym celu skropliny wprowadza się do odbieralnika z kwasem borowym, będącym stosunkowo słabym kwasem. Zobojętnianie kwasu zmienia odczyn i kolor wskaźnika. Pochłoniętą ilość amoniaku odmiareczkowuje się kwasem. Proste.

Nie pamiętam czy sami mineralizowaliśmy próbkę prezed ćwiczeniem, chyba korzystałem z roztworu już przygotowanego. Mętna zalkalizowana próbka gotowała się cały czas:

Aparatura była skonstruowana trochę nieklasycznie:


Odbieralnikiem była zwykła kolbka z mianowanym roztworem kwasu borowego i z dodatkiem odczynnika Tashiro, czyli mieszaniny wskaźników - czerwieni i błękitu metylenowych. W miarę wykraplania amoniaku zawartośc stawała się zielona:

Aby po przemiareczkowaniu zasadą powrócić do głębokiego fioletu:


W tym przypadku azotu było niewiele.

Sama matoda jest dosyć dokładna, ale tak wyznaczoną zawartość białka mogą podwyższać inne substancje też uwalniające azot w formie soli amonowych. Znanym przykładem jest melamina, nagminnie używana przez nieuczciwych producentów do zawyżania zawartości białka w mleku lub paszach. Właśnie to było powodem niedawnego skandalu w Chinach gdzie wypuszczenie na rynek chrzczonego melaminą mleka w proszku spowodowało zatrucie tysięcy niemowląt.

wtorek, 9 lipca 2013

Ostatnio w domu - otrzymywanie i wykrywanie tlenu

Nudząc się dziś w domu i przegrzebując rzeczy, znalazłem w jakiejś fiolce tabletkę nadmanganianu potasu, co przywiodło mi na myśl pewne bardzo proste doświadczenie, jakie każdy może przeprowadzić. Więc oczywiście je zrealizowałem.

Wbrew temu co się często mówi w szkołach, próba z żarzącym się łuczywkiem nie jest właściwie metodą wykrywania tlenu, lecz raczej pokazowym doświadczeniem obrazującym najważniejszą z jego właściwości - zdolność do utleniania a tym samym podtrzymywania spalania. Doświadczenie to jest tak stare i klasyczne, że w jego opisach zachowało się rzadko już dziś stosowane słowo łuczywko, oznaczające drewnianą drzazgę czy cienkie drewienko, do przenoszenia ognia na przykład do odpalania papierosa od pieca. Ciasno skręcony pasek papieru służący do tego samego celu, to fidybus - też rzadkie słowo. W moim przypadku zamiast łuczywka zastosowanie znalazł patyczek szaszłykowy.

Samo przeprowadzanie doświadczenia jest bardzo proste: od tabletki nadmanganianu potasu (manganian VII potasu), łatwo dostępnej w aptekach jako środek odkażający, odłupałem mały okruch i wrzuciłem do próbówki. Równie dobrze może to być fiolka czy tuba, byle długa i nie zbyt szeroka. I dolałem wody aby się rozpuściła.

Otrzymałem więc intensywnie fioletowy roztwór. Z braku stojaka próbówkę włożyłem do butelki. Następnie przyniosłem opakowanie wody utlenionej. Miałem więc zestaw - próbówka z nadmanganianem, woda utleniona, patyczek i zapalona świeca aby odpalić. Mając już wszystko gotowe wlałem wodę utlenioną do próbówki. Fioletowa barwa zanikła, zaś w zamian zawartość zaczęła się burzyć i wydzielać bąbelki czystego tlenu, zgodnie z reakcją:
KMnO
4
+ 3 H
2
O
2
2 MnO
2
+ 2 KOH + 2 H
2
O
+ 3 O
2
Powstający tlenek manganu sam jest katalizatorem rozkładu, dlatego do zapoczątkowania reakcji wystarczy dosłownie okruszek. Teraz zapaliłem patyczek, zdmuchnąłem i jeszcze żarzący wsunąłem do próbówki. Czerwony żar pojaśniał aż do żółci a na drewienku pojawił się płomyczek. Zdmuchnąłem go i jeszcze raz wsunąłem do próbówki ale tym razem skończyło się na rozżarzeniu. Najlepiej pokaże to film:
Gdy zawartość przestała już się burzyć, na dno zaczął opadać kłaczkowaty, ciemnobrunatny osad dwutlenku manganu.

Wysokie stężenia tlenu mogą nie tylko rozpalać już istniejący płomień, ale mogą też doprowadzać do samozapłonu lub wybuchu podatnym na to materiałów. Tragicznym przykładem może być historia programu Apollo 1, zakończonego w trakcie wstępnych testów na ziemi. Astronauci ćwiczyli podstawowe sytuacje w module wypełnionym czystym tlenem pod ciśnieniem. W którejś chwili doszło do pożaru, który rozprzestrzeniał się tak gwałtownie, że po kilkunastu sekundach ciśnienie gazów spaleniowych rozszczelniło kabinę. Wszyscy trzej astronauci zginęli.
Podczas późniejszego dochodzenia okazało się, że w tak wysoce natlenionych warunkach do zapłonu mogły wystarczyć iskry elektryczności statycznej, wywołane ocieraniem kombinezonów o fotele, zaś gumowy rzep użyty w kilku miejscach, staje się wręcz wybuchowy. Podobny przypadek zdarzył się kilkanaście lat temu w jednej z polskich hut szkła. Gwałtowny pożar w części zajmującej się przetłaczaniem sprężonego tlenu zabił kilka osób. Media głupio pisały wówczas że był to pożar tlenu. W rzeczywistości pod wpływem bardzo sprzyjających warunków, zapaliła się uszczelka jednej z pomp. Fala sprężonego tlenu wraz z iskrami zapaliła wszystko w pomieszczeniu - w tym pracowników.

wtorek, 2 kwietnia 2013

Spektrofotometryczne oznaczanie kofeiny w kawie.

Kolejny raz zajmowałem się na zajęciach oznaczaniem kofeiny, ale tym razem w całkiem inny sposób. Poprzednio, jak to pisywałem, wyodrębniałem kofeinę z naparu herbacianego techniką SPE a zawartość wyznaczałem chromatograficznie przez porównanie ze wzorcem. Tym razem postąpiłem jednak inaczej.

Kawa, to napój robiony ze zmielonych nasion krzewu kawowego. Najstarsze wzmianki o niej pochodzą dopiero z końcówki średniowiecza, bez wątpienia jednak musiała być znana od dawna w plemionach górzystej Etiopii. Krzew owocuje czerwonymi jagodami o dużej pestce, która jest wyłuskiwana i suszona (w niektórych łagodnych odmianach pestki poddaje się enzymatycznej fermentacji podobnie jak w przypadku herbaty).  Pestki, nazywane teraz ziarnem kawowym, są następnie poddawane procesowi palenia - przypiekanie w wysokiej temperaturze powoduje częściową degradację substancji o roślinnym posmaku. Jednak powodem dla którego kawę się praży, jest nadanie jej właściwego smaku i zapachu.
W pierwszej fazie następuje karmelizacja cukrów prostych i skrobi w ziarnie; dalsze pieczenie powoduje, że cukry zaczynają reagować z białkami w ciągu skomplikowanych reakcji Maillarda. Powstające produkty tych często nieprzewidywalnych reakcji odpowiadają za silny i zróżnicowany aromat i smak ostatecznego produktu. Czas palenia i temperatura wpływają na stopień przemiany a tym samym na siłę i bukiet aromatu, toteż zależnie od techniki wyróżnia się różne odmiany kawy - na przykład kawa lekka (New England) była pieczona do momentu pierwszego pęknięcia ziarna. Pestki mogą być podpiekane długo w niskich temperaturach, lub szybko w wysokich; palone dwa razy w różnych temperaturach; szybko schładzane lub powoli. To wszystko wpływa na jakość ostatecznego produktu.
Kawa bezkofeinowa jest otrzymywana przez ekstrakcję nadkrytycznym dwutlenkiem węgla zmielonej kawy zielonej. Kawa rozpuszczalna przez zagęszczanie i liofilizację naparu. Ja sam osobiście nie piję kawy.

Spektrofotometria UV/VIS, podobnie jak innozakresowe techniki tego typu, opiera się na jednej podstawowej zasadzie - prawie Lamberta-Beera.W zasadzie są to dwa prawa dotyczące absorpcji w roztworach, które można połączyć w jedno. Zanim je objaśnię przejdę jednak do podstaw.
Różne ciała oddziałują ze światłem w różny sposób. Mogą całkowicie nie przepuszczać go przez siebie, mogą przepuszczać ale częściowo albo mogą przepuszczać całkowicie, jedynie załamując je zależnie od kształtu i gęstości. Aby jakoś ilościowo to opisać, porównujemy natężenia wiązki która wchodzi do ciała i wiązki która przezeń przechodzi, wedle rysunku:

Transmitancja (T) to po prostu stosunek natężeń, często wyrażany w procentach, mówiący jaka część światła przenika przez ciało. Częściej jednak stosuje się wartość nazywaną Absorbancją, będącą ujemnym logarytmem transmitancji, która jest o tyle wygodniejsza, że absorbancje różnych substancji w roztworze, można wprost dodawać do siebie tworząc A. ogólną.

Znając te podstawowe prawidła, możemy zrozumieć w jaki sposób próbowano powiązać absorpcję światła przez ciała, z ich rozmiarami lub stężeniem.
Na samym początku, w roku 1729, Pierre Bougher stwierdził, że natężenie światła przechodzącego przez ciało, maleje wykładniczo z jego grubością. A więc czym grubsza warstwa pochłaniająca, tym mniej światła przez nią przechodzi. Kilka dekad po nim to samo prawo opublikował niejaki Lambert. Z matematycznego opisu tego prawa wymikało, że różne substancje muszą posiadać charakterystyczny dla siebie wspólczynnik mówiący o ich zdolności do pochłaniania światła.
Następnym badaczem był August Beer, który badając absorpcję światła przez roztwory tych samych substancji, w naczyniu tej samej grubości, ogłosił w 1852 roku że absorpcja w takim przypadku zależy z grubsza liniowo od stężenia.
Jeśli uznać za ciało pochłaniające warstwę zabarwionego roztworu, to oba prawa można złożyć w jedno mówiące, że absorbancja roztworu zależy liniowo od - grubości warstwy roztworu l ; stężenia C ; i własnej zdolności absorpcyjnej ε , co określa się wzorem:

A = ε l C
Jest to prawo raczej przybliżone, z odchyleniami dla stężeń bardzo małych i bardzo dużych, jest jednak wystarczająco użyteczne, aby wykorzystać je w chemii analitycznej. Już po koniec XIX wieku zbudowano pierwszy użyteczny przyrząd pozwalający, w oparciu o te prawa, porównać stężenia roztworów - Kolorymetr Duboscq:

Było to proste urządzenie - do jednej z dwóch, jednakowo jasno podświetlonych rurek wlewano roztwór wzorca o znanym stężeniu, do drugiej roztwór badany i do obu wprowadzano szklane pręty. Patrząc na natężenie światła przechodzącego opuszczano bądź jeden, bądź drugi pręt dopóty, aż jasności po obu stronach się zrównały. Głębsze zanurzenie pręta, zmniejszało grubość warstwy między dnem rurki a końcem pręta, a tym samym grubość warstwy roztworu przez jaką przechodziło światło. Ze znanego stężenia roztworu wzorcowego i stosunku grubości warstw roztworów, można było wyliczyć stężenie nieznanego roztworu.
Urządzenie stało się pierwszym przyrządem analitycznym, używanym na przykład w medycynie - po przeprowadzeniu odpowiednich reakcji, zamieniającej składniki moczu lub osocza w barwne produkty, można było oznaczać zawartość białka w moczu lub cukru we krwi.

Współcześnie jednak technika znacznie ułatwiła nam pomiar i zwiększyła jego dokładność, używając fotometrów mierzących natężenie wiązki przechodzącej. Takiego też przyrządu używaliśmy na ćwiczeniu.

Pierwszym krokiem dla wykonania oznaczenia było wybranie kawy - na stanie laboratorium była tylko rozpuszczalna Pedros firmy Ellite:

Z niej odważyliśmy ok 0,05 g w trzech próbkach i zalaliśmy 10 ml gorącej wody, tworzac napar:

zawierający całą kofeinę, ale też resztki białek, polifenole i inne silnie zabarwione substancje, które przeszkadzałyby w oznaczaniu. Należało więc tą kofeinę od całej reszty oddzielić, jednak zamiast techniki SPE, jakiej używałem na ćwiczeniu z herbatą, skorzystałem z techniki bardziej klasycznej - ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym.
Napar po przestudzeniu wlewaliśmy do rozdzielacza i dodawaliśmy chlorku metylenu - bardzo lotnego rozpuszczalnika. Zamiast jednak zazwyczaj wykonywanego silnego wstrząsania, jedynie "przelewaliśmy" ciecze we wnętrzu, pozwalając się im niezbyt gwałtownie przelewać. Kofeina jest w chlorku metylenu stosunkowo dobrze rozpuszczalna, ale ciemne barwniki kawy także; ostrożne mieszanie miało jak najbardziej zmniejszyć ten niepożądany efekt.

Gdy już wytrząsnęliśmy pierwszą porcję odlewaliśmy cięższy roztwór organiczny i do  tej samej raz ekstrahowanej cieczy dolewaliśmy następną porcję rozpuszczalnika. A gdy podobnie przemieszaliśmy je i odlaliśmy chlorek metylenu, powtórzyliśmy ekstrakcję po raz trzeci. Chodziło po prostu o to, aby wyciągnąć z naparu praktycznie całą kofeinę.
Każdy napar z każdej próbki ekstrahowaliśmy osobno, zbierając warstwę organiczną do trzech osobnych próbówek. Jak widać nie zawsze udawało się uniknąć zanieczyszczenie naparem wodnym. Ostatnie kropelki odciągnęliśmy pipetką


Mając już roztwór zawierający kofeinę, należało nią z niego wyodrębnić - toteż przelaliśmy go do porcelanowej parownicy i odparowaliśmy niskowrzący rozpuszczalnik na łaźni piaskowej. Tak, wiem, że to mało oszczędny sposób, ale tak było w przepisie. Gdy rozpuszczalnik wrzał zauważyłem na jego powierzchni ciekawe zjawisko "pływającej kropli" - czy też raczej pół-antybańki.
Normalna bańka składa się z gazu oddzielonego od gazu zewnętrznego cienką błonką cieczy, napiętą przez detergent powierzchniowo czynny. W szczególnych warunkach można jednak stworzyć układ dokładnie odwrotny - kropla cieczy oddzielona od reszty błonką powietrza. Taka antybańka unosi się swobodnie wewnątrz roztworu.
Zjawisko jakie obserwowałem stanowiło coś pośredniego - kropelka cieczy unosiła się na powierzchni roztworu, będąc od niego oddzielona błonką powietrza, ale tylko na spodniej stronie. Powietrze to zmniejsza tarcie między kroplą a resztą roztworu na tyle, że kropla bardzo szybko śmiga począwszy od miejsca powstania. Jest to zjawisko obserwowane bardzo często, widziałem je na kałużach do których wpadał strumień deszczówki, na mieszanej herbacie, u podnóża wodospadów a nawet wewnątrz muszli klozetowej podczas załatwiania małej potrzeby fizjologicznej. Także gdy kran w laboratorium kapie na cienką warstwę wody na dnie zlewów, też widzę kropelki szybko śmigające po tej warstewce.
Te "połkrople" czy też jak ja nazywam, pływające krople, na powierzchni wrzącego chlorku metylenu zaciekawiły mnie dlatego, że spontanicznie rosły - najwyraźniej na niestabilnej powierzchni w warunkach minimalnej lepkości, małe porcje cieczy przechodziły do kropli, powiększając ją.

Gdy cały rozpuszczalnik odparował, na dnie parowniczki pozostał osad, zawierający kofeinę i zanieczyszczenia:

Osad rozpuszczaliśmy w niewielkiej ilości wody, przelewaliśmy ją do kolby miarowej i po uzupełnieniu do kreski otrzymywaliśmy 100 ml roztworu kofeiny z kawy. Czynności wykonaliśmy osobno dla każdej próbki, uważając aby ich nie pomieszać. Z powodu zanieczyszczeń roztwór był lekko zabarwiony:

Niestety nasz spektrofotometr akurat się zepsuł i oznaczenie musieliśmy odłożyć na następne ćwiczenia.
Na kolejnych ćwiczeniach zaczęliśmy od przygotowania serii roztworów wzorcowych, o stężeniach kofeiny zmieniających się od 0 do 0,9 mikromola/ml, następnie wybraliśmy jeden z nich i po przelaniu do kwarcowej kuwety mierzyliśmy zależność absorbancja/długość foli, aby znaleźć warunki w których pochłanianie światła jest największe. W naszym przypadku była to fala 279 nm.

Gdy długość fali była już ustalona, reszta oznaczania była prosta - najpierw zmierzyliśmy absorbancje kolejnych roztworów wzorcowych a następnie naszych roztworów otrzymanych z kolejnych próbek. I już tutaj pojawił się pierwszy zgrzyt - absorbancja próbek badanych wyszła większa niż roztworów wzorcowych i powyżej 1, a więc pochłanianie w tej długości fali było bardzo silne. Nie lepiej było gdy doszło do opracowywania wyników.
Najpierw wykonałem wykres zależności stężenie/absorbancja, nie wyglądał zbyt dobrze:

Uznałem więc że wartość w punkcie 2 to błąd gruby i usunąłem go, uzyskując ładną linię prostą:

wraz z równaniem tejże prostej. Wiedząc że Y to absorbancja, a X to stężenie, mogłem wyliczyć z tego wzoru stężenie kofeiny w trzech roztworach badanych - o ile oczywiście nadal stosowała się do nich zależność prostoliniowego odcinka krzywej.
Po przeliczeniu otrzymałem stężenie kofeiny w roztworach w mikromol/ml. Znając objętość roztworów przeliczyłem stężenie na ilość a tą, znając masę molową kofeiny, na masę. Znając teraz masy odważonych próbek kawy i masy wyliczonej kofeiny w nich zawartej, mogłem policzyć procentową zawartość kofeiny w kawie. Po uśrednieniu zbliżonych wyników wyniosła ona 4,28%

Siła kawy jest zatem niczego sobie, tyle tylko, czy jest to wartość realna? Jak wynikałoby z badań, w większości przypadków kawy dostępne na rynku zawierają od 1 do maksymalnie 2,5% kofeiny [1] zatem w moim przypadku wynik jest dwa razy większy.
Co mogło być źródłem błędu? Jakiś wpływ może mieć błąd ujemny, związany z niecałkowitą ekstrakcją kofeiny, ale zdecydowanie większy wpływ ma błąd dodatni wywołany ciemnymi zanieczyszczeniami z pierwotnego ekstraktu. Ostrożna ekstrakcja miała pomóc ich uniknąć, ale najwyraźniej nie była wystarczająca. We wcześniejszym ćwiczeniu z herbatą kofeina została oddzielona i zatężona przy pomocy techniki SPE a właściwa analiza była przeprowadzane przez porównanie powierzchni pod wykrytym przez detektor pikiem kofeiny z próbki i z roztworu wzorcowego. Zatem przed dojściem do detektora kofeina została oddzielona od zanieczyszczeń i sygnał pochodził tylko od niej.
Wiem że inne grupy badające tą kawę otrzymały niższe wartości, rzędu 2,5-3% więc widocznie etap ekstrakcji wykonały ostrożniej. Bywa.

------------
[1] Marcin Frankowski, Artur Kowalski, Agnieszka Ociepa, Jerzy Siepak, Przemysław Niedzielski, Kofeina w kawach i ekstraktach kofeinowych i odkofeinizowanych dostępnych na polskim rynku, BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XLI, 2008, 1, str. 21 – 27

środa, 20 lutego 2013

Chromatograficzne oznaczanie zawartości kofeiny w herbacie

W ostatnim czasie trochę nie bardzo miałem czas na wpisy na blogu, zwłaszcza że te dopiero przygotowywane są dłuższe i wymagają większej pracy, dlatego aby nie zaniedbać tego miejsca całkowicie, przedstawię coś wygrzebanego z archiwum notatek.

Kofeina jest naturalnym alkaloidem zawierającym azot, o właściwościach lekko zasadowych, wstępującym w wielu roślinach, głównie w krzewie kawowym i krzewie herbacianym. Napoje otrzymywane z tych roślin nie miały by dla nas wielkiej wartości gdyby nie ów związek, a to z powodu pobudzających właściwości. Kofeina zmniejsza poczucie zmęczenia, rozszerza naczynia krwionośne, pobudza wydzielanie soków żołądkowych i moczu, zwiększa wydzielanie neuroprzekaźników dając krótkotrwały efekt "jasności umysłu"; niestety jak wszystkie substancje wpływające na percepcję prowadzi do fizycznego uzależnienia, choć lekkiego. Dlatego też ludzkość spożywa ją tonami.

W ćwiczeniu jakie wykonywaliśmy na zajęciach chodziło wprawdzie o oznaczenie ilości kofeiny w herbacie, ale główną sprawą na jaką zwracano naszą uwagę, był sposób przygotowania próbki - konkretnie zaś technika SPE.

W procesie analitycznym samo badanie i interpretacja wyników stanowią dosyć krótki etap, natomiast przygotowanie próbki tak, aby można było ją zbadać niejednokrotnie okazuje się najbardziej czasochłonną częścią. W dodatku musi być to etap wykonany dokładnie, bo choćby sprzęt pomiarowy był supernowoczesny, to wynik oparty o badanie złej próbki nadaje się tylko do kosza. Dlatego też sposoby przygotowania próbek to dziedzina równie szeroka i dynamiczna jak metody analityczne. Jednym z tych sposobów jest ekstrakcja do fazy stałej czyli właśnie SPE.
W pewnym stopniu można zaliczać SPE do chromatografii, gdyż i tutaj i tu używa się kolumny wypełnionej adsorbentem, różnica jest jednak taka iż w chromatografii stosujemy ciągły przepływ rozpuszczalnika, chcąc uzyskać ruch w kolumnie, z różnymi prędkościami, składników analitu; natomiast w SPE chodzi o to, aby to co zostanie wchłonięte, pozostawało na adsorbencie tak długo jak to nam będzie potrzebne. Właściwie jest to technika mająca pomóc oddzielić to co nas interesuje od tego co nam przeszkadza, a często też mogąca zagęścić składnik występujący w śladowych ilościach.

Na przykład mamy do czynienia ze ściekami, w których chcemy oznaczyć benzen. Ścieki zawierają całe mnóstwo składników o różnorodnych właściwościach, przez co niektóre czułe detektory mogą zostać całkiem zdezorientowane, należy zatem oddzielić to co niepotrzebne, a więc sole, białka, aminokwasy, kwasy organiczne, alkohole i cokolwiek innego, od frakcji właściwej, zawierającej niepolarne rozpuszczalniki organiczne. Przepuśćmy więc nasz roztwór przez jakiś niepolarny adsorbent, który będzie takie rozpuszczalniki dobrze pochłaniał. Niepolarne substancje zostaną pochłonięte, zaś polarne będzie można wypłukać czystą wodą. Teraz przepłuczmy nasz absorbent czymś, co może wypłukać niepolarne substancje, na przykład heksanem, a otrzymamy roztwór zdecydowanie prostszy w analizie, bo zawierający wyodrębnione ze ścieków same tylko substancje niepolarne, w tym nasz benzen. Jeśli w dodatku przedtem występował w próbce w niewielkich ilościach, to po wymyciu z adsorbenta niewielką ilością rozpuszczalnika zdecydowanie się zatęży. Odwrotnym przypadkiem jest przepuszczanie próbki przez adsorbent, na którym zatrzymają się przeszkadzające zanieczyszczenia.
I to jest w zasadzie cała istota techniki.

Przemywania dokonuje się zazwyczaj w krótkich, szerokich kolumienkach, przypominających strzykawki, często przepływ przyśpiesza się podłączając wylot kolumienki pod niższe ciśnienie

W techniczne szczegóły nie będę się tu na razie wdawał, czas bowiem przejść do opisu ćwiczenia.

Na początek wzięliśmy kilka torebek herbaty ekspresowej (chyba "Minutki") i po rozerwaniu odmierzyliśmy dokładnie 0,85 g, po czym wsypaliśmy do kolby. Zaraz potem wsypaliśmy tam 2 g tlenku magnezu:

I dolaliśmy gorącej wody. Wyciąg należało zaparzać przez kwadrans. Po co tlenek magnezu? Zmieszany z wodą częściowo reagował dając wodorotlenek, i nadając roztworowi łagodnie zasadowy odczyn. W normalnej sytuacji kofeina tworzy z garbnikami herbacianymi mało rozpuszczalne połączenia, więcej jest ich w herbacie zielonej stąd też może mieć ona słabsze działanie pobudzające niż czarna. Zasadowe środowisko powoduje rozpad tych połączeń i większy stopień ekstrahowania z fusów. Ponadto w takich warunkach kofeina nie przechodzi  formę jonową, co ma znaczenie dla dalszego przebiegu ćwiczenia. Gdy nasza herbatka była już gotowa, należało ją przesączyć, oddzielając fusy i tlenek magnezu.
użyta kolumienka zawierała jako adsorbent żel krzemionkowy C-18, to jest z przyłączonymi do powierzchni osiemnastowęglowymi łańcuchami węglowodorowymi. Takie wypełnienie jest zatem bardzo niepolarne. Kofeina w formie niejonowej jest bardzo słabo polarna, mimo całkiem sporego momentu dipolowego, dlatego jest pochłaniana. Zanim jednak przepuściliśmy przez kolumienkę nasz roztwór, przepłukaliśmy ją metanolem, aby dotychczas suchy adsorbent był gotowy do pracy, zaś łańcuchy C-18 mogły się rozprostować.

Nabralliśmy 2 ml naparu i przepuściliśmy przez kolumienkę, której wypełnienie zabarwiło się na brązowo:

Gdy już wszystko zostało wchłonięte, przepłukaliśmy kolumienkę metanolem z wodą amoniakalną, aby wypłukać to co nie potrzebne, a na sam koniec wysuszyliśmy złoże, to jest, pozwoliliśmy aby podciśnienie zassało przezeń powietrze.
Tak więc potrzebną frakcję substancji niepolarnych - w tym kofeiny - mieliśmy już wchłoniętą. I czym ją teraz wypłukać? Moglibyśmy użyć rozpuszczalnika organicznego, ale ten wypłukałby nam wszystko co tam jest, a już po brązowym kolorze wypełnienia można było poznać, że oprócz kofeiny jest tam wiele innych związków. Przypomnę teraz że kofeina,, jak wszystkie alkaloidy, zawiera azot o właściwościach zasadowych - a więc mogący przyjmować proton. Po przyjęciu protonu alkaloid przechodzi w formę jonową z ładunkiem dodatnim. A taka forma jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i słabo adsorbowania na podłożach niepolarnych.
Zatem przepłukaliśmy naszą kolumienkę mieszaniną wody, metanolu i kwasu octowego, uzyskując żółtawy roztwór, zawierający kofeinę i niezbyt dużą ilość przeszkadzających zanieczyszczeń. Najwyraźniej niektóre garbniki mają na tyle zbliżone właściwości aby przechodzić przez kolejne etapy w podobny sposób.

Dalsza analiza została przeprowadzona za pomocą chromatografii cieczowej - szerzej opisuję ją w tym wpisie . Najpierw na kolumnę nastrzyknięto próbkę wzorca kofeiny, o stężeniu 0,05 µg/ml, otrzymując chromatogram z pikiem o czasie retencji 14,293 minuty. Potem wstrzyknęliśmy próbkę z przygotowanego przez nas roztworu, uzyskując podobny pik o tym samym czasie retencji, muszący być analizowanym związkiem. Pola pod pikami wynosiły 1 224 259 jednostek względnych dla wzorca i 731 882 dla próbki analizowanej. Detektor fotometryczny mierzył absorpcję w ultrafiolecie dla fali 272 nm.
Znając masę próbki, stężenia wzorców i wiedząc jaki procent pierwotnej próbki stanowiła ta ostateczna, można było wyliczyć zawartość kofeiny w herbacie na 5% suchej masy, co stanowi dość dużą wartość (źródła podają zwykle, że dla herbaty zawartość nie przekracza 4,5%), choć oczywiście w normalnym przypadka nie cała ilość przechodzi do naparu.
Nie taka zła ta herbata

poniedziałek, 17 grudnia 2012

Kiedyś w laboratorium (19.)

W zeszłym roku miałem krótko zajęcia ze spektroskopii w podczerwieni. Zależnie od długości fali promieniowania, otrzymywane są różne widma. W spektroskopii podczerwonej badamy pasma adsorpcyjne, to jest zakresy podczerwieni pochłaniane przez daną substancję. Odpowiadają one odpowiednim grupom w cząsteczce - wiązaniom podwójnym, grupom karbonylowym, aminowym, laktamowym itd. Szerokość, natężenie i położenie pasma pozwala nam dużo powiedzieć na temat budowy cząsteczki. W zasadzie w dużym stopniu widma danego związku są unikalne i wyłącznie dla niego przeznaczone - ale niestety nie zawsze się to udaje.

Aby uzyskać widmo należy przemiatając całe spektrum prześwietlać próbkę związku. Gdy mamy ją w postaci płytki kryształu lub jednolitej masy, nie jest to znów takie trudne, zwykle jednak mamy do dyspozycji drobne kryształki. Najczęstszym sposobem jest zmieszanie naszego związku z dobrze utartym bromkiem potasu, który to dobrze przepuszcza podczerwień. Otrzymany proszek wsypuje się do prasy, opuszcza stempel i pod bardzo wysokim ciśnieniem prasuje "pastylkę". Chlorki, bromki i jodki sodu i potasu pod wysokim ciśnieniem stają się nieco plastyczne - czego spektakularny przykład stanowią wysady solne, a więc maczugowate porcie soli kamiennej, wypchnięte z warstwicowych pokładów przez jakieś osłabienie czy niespoistość warstw. W tym przypadku plastyczność powoduje, iż otrzymujemy półprzezroczystą masę, na tyle trwałą aby nadawała się do badań.
Jedną taką pastylkę robiłem własnoręcznie, gdy zaś wyjąłem podkładkę ze stempla, stwierdziłem że masa została w intrygujący sposób wypchnięta przez szczelinę przy stemplu:

poniedziałek, 10 grudnia 2012

Analiza tlenu rozpuszczonego

Na jednym z ostatnich zajęć Chemii Środowiska, z prof. N. Erchakiem (Jerczakiem) analizowaliśmy zawartość tlenu rozpuszczonego w próbkach wody.

Kiedyś kiedyś znajoma rodziny wspominała, że gdybyśmy tak na zajęciach badali wodę, to ona dałaby trochę ze studni, ot tak aby sprawdzić jaka jest. Nie wiedziałem wówczas czy faktycznie znajdzie się okazja, ale na wszelki wypadek obiecałem, że dam jej znać. Gdy więc okazało się, że przez kilka kolejnych zajęć będziemy analizowali wodę, którą należy przynieść z domu, poprosiłem ją aby nalała mi do szklanej butelki aż po samą zakrętkę. Na kolejnych zajęciach badaliśmy zawartość amoniaku, twardość i kwasowość, zawartość fosforanów, zawartość azotu w azotanach aż na sam koniec zawartość tlenu. Moim zdaniem kolejność powinna być odwrotna, tj. tlen powinno się badać na początku, ale tak wylosowaliśmy numerację ćwiczeń w dwuosobowej grupie.

Zawartość tlenu jest dosyć ważnym parametrem dla wód powierzchniowych. Jego obecność w wodzie umożliwia życie zwierzęce i w pewnym stopniu zapobiega rozwojowi beztlenowych bakterii gnilnych, powodujących zatrucie wód. W wodzie pozostającej w kontakcie z powietrzem w stanie nasycenia, zawartość tlenu może wynieść ok. 15 mg/l, zaś azotu dwa razy więcej (w powietrzu azotu jest trzy razy więcej). Właściwe natlenienie wody sprzyja procesom samooczyszczania, natomiast zbyt niskie może prowadzić do śnięcia ryb. Spektakularny tego przykład miałem okazję obserwować trzy lata temu, podczas lipcowej powodzi na nizinnej rzece Krzna - woda mimo wysokich temperatur zalała wtedy duży obszar trawiastych łąk i ogrodów; gnijąca materia organiczna doprowadziła do masowego śnięcia ryb, które wyławiano tonami. Zatruta woda z Krzny, Zielawy i podobnych rzek zatruła Bug, a ten Zalew Zegrzyński. Smród było czuć w całym mieście.
Zasadniczo nie ma określonych norm zawartości tlenu w wodzie pitnej - określa się jedynie, że natlenienie powinno być zbliżone do stanu nasycenia.

Technika jaką badaliśmy zawartość tlenu to ta sama dobra jodometria o której już tu szeroko pisałem, jednak w tym przypadku jest to wersja nieco bardziej skomplikowana.

Na sam początek należało zatem wziąć naszą wodę i nalać do szklanej buteleczki ze szlifem, aż pod sam korek aby nie fałszować wyniku nowymi porcjami rozpuszczonego powietrza - co, jak się rzekło, było na piątej pracowni jak musztarda po obiedzie. Następnie dolałem do niej silnie zasadowego roztworu jodku potasu. Następnym odczynnikiem był kwaśny roztwór siarczanu manganu II o stężeniu 30%, dzięki czemu dobrze było widać zazwyczaj trudną do zauważenia różową barwę jonu:

Roztwór manganu należało teraz szybko wlać do naszej wody, co skutkowało natychmiastowym wytrąceniem się osadu, zrazu kremowego:


Z czasem gęstniejącego do lekko brunatnej galaretki:

W tym momencie zachodziły w roztworze dwie reakcje, mangan II w zasadowym środowisku tworzył wodorotenek:
Mn2+ + OH - Mn(OH)2

Który pod wpływem rozpuszczonego tlenu zamieniał się w tlenek-wodorotlenek manganu IV:
2Mn(OH)2 + O2 2MnO(OH)

Teraz należało zakwasić roztwór kwasem siarkowym. Osad znikał w oczach, zaś roztwór stał się lekko żółtawy. Powstający z rozpuszczenia osadu mangan IV jest w warunkach kwaśnych utleniaczem, który utlenia jony jodkowe do wolnego jodu:
Mn4+ + 2I -  → I2 + Mn2+
Teraz zatem mamy roztwór zawierający jod, który możemy poddać miareczkowaniu. Procedurę takiego miareczkowania już opisywałem, więc tylko w skrócie - miareczkujemy roztwór tiosiarczanem sodu, będącym dobrym reduktorem, aż do zaniku zabarwienia jodu. Aby uchwycić dobrze punkt końcowy pod koniec miareczkowania dodajemy zawiesinę skrobi, dającej z jodem barwny kompleks.
Piałem tu już, że z wszystkich filmów miareczkowań, mam najwięcej tych jodometrycznych - i oto ledwie kilka dni po napisaniu tych słów nakręciłem kolejny, ale tym razem miareczkowanie poszło mi tak szybko i z tak wyraźnymi przemianami, że wyszedł całkiem niezły filmik:

Ostatecznie stopień natlenienia wody wyniósł ok. 50%, czyli nie tak źle.

niedziela, 22 stycznia 2012

Błąd na błędzie - czyli analiza nieznanego związku organicznego

Tyle już tu pisałem o tym, że ludzie popełniają błędy, że w historii chemii zdarzały się pomyłki i mistyfikacje, że należy odnośnie głośnych i nowych odkryć zachować ostrożność, a jak przyszło co do czego sam się przed nimi nie ustrzegłem. W zasadzie więc nie ma się czym chwalić, jednak po fakcie pomyślałem, że moja historia może zawierać w sobie pewien sens moralny, albo po prostu nauczkę co do tego, o czym analityk powinien pamiętać oraz - a również i zwykłym czytelnikom może być to przydatne - na co powinien najbardziej uważać. A uważać powinien na siebie.

Przedmiot analiza związków organicznych jaki mam w tym roku, idzie mi tak sobie. Sporo reakcji już pozapominałem, więc na kolokwiach raczej nie błyskam nadzwyczajnymi wynikami, w zasadzie jednak praktyka powinna mi iść dobrze. I tak mi się też wydawało, gdy bez większych problemów oznaczyłem tożsamość pierwszego nieznanego związku.
Była to substancja stała, drobnokrystaliczna i jasnofioletowa z ciemniejszymi grudkami, o wyraźnym, ostrym zapachu fenolu. Topiła się w zakresie 59,5-62 st. C; nie rozpuszczała się w wodzie i 5% roztworze wodorowęglanu sodu, natomiast rozpuszczała w 10% NaOH co zaliczało ją do grupy rozpuszczalności KW. 2. Spalała się żółtym, kopcącym płomieniem, gasnącym po wyjęciu, wydzielając przy tym opary które po ostrożnym wwachlowaniu dłonią pod nos okazały się bardzo ostre i kręciło mnie po nich jeszcze następnego dnia. Z heteroatomów wykryłem tylko brom. Pomyślałem zatem - pachnie fenolem, pali się jak związek nienasycony - a sprawdzajmyż czy to jakiś fenol. Rozmieszałem trochę z wodą w której odrobinkę się rozpuszczał i dodałem żelaza III. Roztwór zabarwił się butelkowo z fioletowawym odcieniem przy dnie - więc jakiś fenol to jest. Dla otrzymania pochodnej krystalicznej potraktowałem próbkę rozpuszczoną w alkoholu, nitrującą mieszaniną kwasu azotowego i azotanu III sodu. Po przekrystalizowaniu, odsączeniu, przemyciu i wysuszeniu, zbadałem że moja nitropochodna, mająca postać jasnopomarańczowego proszku, topi się w zakresie 98-104 st. C.
Potem zajrzałem do odkserowanych z podręcznika tabel fizykochemicznych, wyszukałem związek najbardziej pasujący a prowadzący potwierdził - był to para-bromofenol. Proste.

Teraz należało zająć się drugim związkiem. Była to ciecz, bezbarwna, wodnista o wyraźnym migdałowym zapachu - jak nic, myślę sobie, albo benzen albo alkilopochodna. Więc sprawdzam rozpuszczalność - w wodzie nie, w 5% NaOH nie, w 5% HCl nie, w stęż. H2SO4 tak z rozkładem, w steż. H3PO4 tak. Zatem moja substancja należy do grupy rozpuszczalności O1. To też pasuje - pomyślałem.
Zatem palność: pomarańczowy, nie gasnący płomień, tak silnie kopcący aż obawiałem się, że będę musiał myć dygestorium. Następnie przedestylowałem próbkę, mierząc temperaturę par - w pewnym momencie temperatura zaczęła utrzymywać się na stałym poziomie, odpowiadającym temperaturze wrzenia, która w tym przypadku wyniosła 173 st. C. Zdecydowanie za wysoko na benzen (80 °C) ale pozostawały jeszcze pochodne.

Następnie heteroatomy - po stopieniu próbki z sodem, i rozprowadzeniu w wodzie nie wykryłem siarki, azotu i halogenów. Więc heteroatomów raczej nie ma. Pasuje

I cóż? Swoją teorię już miałem i się jej uparcie trzymałem. Najpierw więc próba na grupę aromatyczną. Zmieszałem próbkę z chloroformem i nasypałem łopatką odrobinę bezwodnego chlorku glinu, tak aby osiadł na ściance - zauważyłem przy okazji, że pył bezwodnego związku osiadający na skórze daje przejściowe uczucie ciepła. Następnie przechyliłem próbówkę aby ciecz zwilżyła związek, i obserwując powstające zabarwienie byłem pewien, że mam związek aromatyczny:
Barwne związki


Próba ta opiera się na dosyć ciekawym mechanizmie:
Schemat reakcji

Najpierw chloroform reaguje z chlorkiem glinu będącym, jak powszechnie wiadomo, kwasem Lewisa. Ten przyłączył jeden chlor i utworzył z chloroformem nietrwałe połączenie o charakterze pary jonowej, gdzie na kompleksie nieorganicznym mamy ładunek ujemny a na części organicznej ładunek dodatni. Następny etap to substytucja elektrofilowa i przyłączenie reszty chloroformu do pierścienia aromatycznego. Jest to w zasadzie zwykła reakcja Friedla i Craftsa. Ponieważ w reszcie pochodnej od chloroformu nadal znajdują się atomy chloru, wobec nadmiaru chlorku glinu - a pamiętajmy że nasza reakcja zachodzi w grudkach związku zwilżonych naszą mieszaniną - reakcja się powtarza. W powyższym przykładzie benzen ulega zamianie w trifenylometan, ale jest na prawdę wiele innych możliwości, z polimerami włącznie. Całość tworzy związki o dużej ilości struktur mezomerycznych, które pochłaniają różne długości fal i odznaczają się silnym zabarwieniem. Tutaj pojawił się kolor fioletowy, więc związek aromatyczny to był.
Pasuje - myślę sobie zatem. Ponieważ temperatura wrzenia nie pasowała do benzenu, dla potwierdzenia że mam do czynienia z pochodną alkilową, wytrząsałem próbkę z zakwaszonym roztworem manganianu VII potasu, który mi się odbarwił, co uznałem za potwierdzenie koncepcji. Z temperatury wrzenia pasował p-cymen. Niestety w tym momencie skończyły mi się zajęcia i ostateczną identyfikację odłożyłem na później.

Na następnych zajęciach zabrałem się za otrzymywanie pochodnej krystalicznej. Dla związków aromatycznych taką wygodną jest pochodna benzoilowa, to jest z przyłączonymi resztami kwasu benzoesowego. Substratem w tej reakcji jest chlorek kwasowy, czyli chlorek benzoilu, związek o specyficznym, bardzo silnym zapachu, który pomimo przeprowadzania reakcji pod dygestorium, zasmrodził całą salę. Moją substancję, rozpuszczoną w alkoholu, zmieszałem z 10% wodorotlenkiem sodu, dodałem 1 ml chlorku benzoilu i wytrząsałem aż roztwór przestał śmierdzieć, co znamionowało koniec reakcji.
Benzoilowanie


Wytrącony osad odsączyłem na lejku Buchnera, przemyłem ostrożnie odrobiną wody dla wymycia kwasu benzoesowego, który też powstaje w tej reakcji, nabiłem nim kapilarkę i zacząłem mierzyć temperaturę topnienia. Mierzyłem i mierzyłem. Mierzyłem powoli i ostrożnie. Mierzyłem z uwagą i powagą. Mierzyłem aż się znudziłem a temperatura na termometrze sięgnęła 350 st. C. Dalej nie chciałem ogrzewać, bo się skala kończyła a obudowa zaczęła podejrzanie pachnąć spalenizną, zaś moja pochodna topić się nie chciała. Żaroodporna pochodna, coś takiego! Prowadzący też się zdumiał i po moich ostrożnych zapytaniach kazał sprawdzić inne grupy funkcyjne.
No cóż, może coś przeoczyłem. Najpierw więc grupa alkoholowa, bo może to alkohol benzylowy, on też powinien pachnąć migdałami. W tym momencie niektórzy czytelnicy mogą się już domyśleć co też takiego miałem w próbówce, ja jednak nie skojarzyłem, i brnąłem dalej w pochodne podstawionego grupami alkilowymi benzenu jak to sobie na początku założyłem.
Próba Lucasa pozwalała w zasadzie na odróżnienie od siebie alkoholi o różnej rzędowości i była raczej niemiarodajna, ale odczynnika cerowego nie miałem. Do odmierzonej ilości stężonego kwasu solnego wsypałem chlorek cynku i po rozpuszczeniu dodałem mój związek. Podręcznik podawał, że dla alkoholi III rzędowych natychmiast a dla II rzędowych po pewnym czasie, powinno pojawić się zmętnienie a nawet oddzielenie się warstewki żółtawego oleju chloropochodnej (a dla I rzędowych nic), dlatego gdy po zmieszaniu wszystkiego roztwór zabarwił się tak żółtawo, uznałem próbę za trafioną.
Próba Lucasa, wynik fałszywy


Tabele z podręcznika podawały, że zbliżoną temperaturę wrzenia ma furfurol, więc od razu zapytałem prowadzącego czy to to. Nie, to nie alkohol. Trudno.

Nie alkohol, więc najlepiej sprawdzić od razu grupę karbonylową. Podręcznik podawał tu przepis na próbę z dinitrofenylohydrazyną, gdzie należało roztwór alkoholowy odczynnika dodać do próbki i w razie czego powinien wytrącić się osad odpowiedniej pochodnej, zgodnie z równaniem:
Powstawanie dinitrofenylohydrazydów


Odsypałem sobie zatem łyżeczkę pomarańczowego związku, wsypałem do próbówki, dodałem badaną próbkę i po wymieszaniu otrzymałem klarowny, pomarańczowy roztwór. Osad niet.
Dla pewności, że nie ma żadnej pomyłki, zrobiłem jeszcze próbę Legala, ograniczoną raczej do metyloketonow. Podczas tej próby metyloketony, reagując z pentacyjanonitrozylożelazianem III sodu (nitroprusydkem wedle starej nomenklatury), tworząc podobno alfa-c-nitrozoketony, ale tej znalezionej na jednej ze stron informacji nie udało mi się potwierdzić. W każdym razie po reakcji w zasadowym roztworze i po zakwaszeniu go kwasem octowym, powinno powstać fioletowe lub czerwone zabarwienie.
I rzeczywiście, gdy wymieszałem co trzeba i chlupnąłem octem, roztwór zrobił się czerwony a warstwa organiczna w intrygujący sposób się wzburzyła przy dnie, tworząc efektowne warstwy:
Próba Legala


A zatem jakiś metyloketon. Zajrzałem do podręcznika i uznałem, że musi to być fenolo-metylo keton. Pełen nadziei zapytałem prowadzącego - pudło! Ponadto po przesłuchaniu mojej relacji kazał powtórzyć pierwszą próbę na grupę karbonylową, tylko porządnie, i to będzie moja pochodna krystaliczna. Zajrzałem jeszcze raz do podręcznika: "alkoholowy roztwór dinitrofenylo..." - ale co tu zmieni alkohol, myślę sobie, on raczej nie bierze udziału w reakcji. Dla spokojności sumienia chlupnąłem do próbówki z otrzymanym wcześniej klarownym roztworem trochę alkoholu i oczywiście wytrącił mi się ładny, pomarańczowy osad:
Ostateczna pochodna


Zajrzałem jeszcze że ta pochodna, jest używana dla potwierdzenia tożsamości aldehydów i złapałem się za głowę. Jak mogłem o tym zapomnieć?! Przecież używałem tego związku. I opisałem. No ale...
Na następnych zajęciach, bo tamte mi się kończyły, odsączyłem pochodną, wysuszyłem, zbadałem temperaturę topnienia (228-231 st. C ) i oczywiście wyszło mi że moją substancją był benzaldehyd.

Aldehyd benzoesowy jest taką właśnie cieczą, pochodną benzenu, o silnie migdałowym zapachu. Nic zresztą dziwnego bo występuje w migdałach wraz z kwasem migdałowym i cyjanowodorem, a wszystkie te produkty hydrolizy cyjanoglikozydów pachną migdałowo. Taka prosta sprawa a ja się tyle męczyłem.

Oczywiście teraz już mogę wskazać gdzie popełniłem błąd, a był już na samym początku. Skoro moja substancja należała do grupy rozpuszczalności O1 to nie mogła być zupełnie niepolarną alkilopochodną aromatyczną, bo te należą do grupy N, ale byłem tak przekonany, że po zapachu odgadłem związek, że nie zwróciłem na to uwagi. Wyszło, że to związek o charakterze obojętnym, więc pasowało. Dlatego po potwierdzeniu aromatyczności nie sprawdzałem dalej i zupełnie niepotrzebnie otrzymałem pochodną benzoilową. Dlaczego wyszła "żaroodporna" nie wiem. Potem na samym początku źle wykonałem próbę na grupę karbonylową bo uznałem, że rozpuszczenie w alkoholu nie ma znaczenia dla wyniku i biedziłem się co dalej. I tak na identyfikację prostego związku zużyłem trzy pracownie.

A teraz morał:
Nie myśl mój czytelniku analityku, żeś za mądry, że od razu wszystko wiesz. Owszem, intuicja się przydaje, ale co innego przeczucie a co innego zaślepienie na to, co nie pasuje. Lepiej dłużej po kolei, na wszelki wypadek posprawdzać inne rzeczy, niż dojść po mozołach do pewnego punktu, i stanąwszy na nim powiedzieć "jestem w kropce". Nie sądź żeś lepszy niż autorzy podręczników, nie myśl, żeś mądrzejszy i nieomylny, bo tylko głupi sądzi, że nie myli się nigdy.
A ma też ta rada odniesienie do innych spraw,
nie chemicznych i nie analitycznych,
czego spokojne rozważenie
zostawiam czytelnikom.